Exosome作為活細胞分泌的含有RNA和蛋白質(zhì)的微囊，大小為30-100nm，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多種體液中。最新研究表明，體液中 exosomal RNA （特別是miRNA、piRNA和lncRNA等非編碼RNA）在不同的疾病模型中存在明顯的表達差異。同時，這些分子被exosomes的脂膜所包裹和保護，能保持其原有穩(wěn)定性和生物學(xué)功能，有望成為液體活檢的重要分子標(biāo)志物。
通過exosome lncRNA測序技術(shù)，可以開發(fā)針對復(fù)雜疾病的無創(chuàng)早期檢測標(biāo)志物；指導(dǎo)針對復(fù)雜疾病特別是腫瘤的個性化治療；用于疾病的預(yù)后判斷，特別是循環(huán)系統(tǒng)疾病和腫瘤。
華銀采用全球領(lǐng)先的exosome RNA富集和提取技術(shù)，并結(jié)合微量RNA建庫和高通量測序技術(shù)，提供exosome lncRNA研究整體解決方案，為廣大的生物醫(yī)學(xué)研究者提供最高質(zhì)量的技術(shù)服務(wù)。
1、實驗方案
測序策略：Illumina 平臺 PE150
數(shù)據(jù)量：12G clean data
2、技術(shù)優(yōu)勢
（1）更佳的提取方法：針對客戶樣本類型，提供不同的提取方法（超離法或試劑盒法等），提高外泌體質(zhì)量；
（2）更優(yōu)質(zhì)的改良：在提取外泌體之前，免費給客戶提供過膜處理的選擇，可進一步增加樣本純度（僅限細胞上清和其他體液）；
（3）更全的鑒定實驗：提供外泌體透射電鏡觀測、粒徑分析、表面標(biāo)志蛋白檢測共三項鑒定服務(wù)，滿足MISEV2018指南對胞外囊泡的鑒定要求；
（4）更領(lǐng)先的建庫策略：采?獨有的微量建庫技術(shù)，極?提高建庫成功率；
（5）更合適的技術(shù)方案：針對不同的外泌體ncRNA(miRNA、lncRNA、circRNA)研究熱點，量身打造最優(yōu)解決方案。
3、數(shù)據(jù)分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評估
（2）核糖體RNA去除率計算
（3）比對參考基因組及統(tǒng)計
（4）基因表達水平分析
（5）基因表達差異及聚類分析
（6）差異基因KEGG生物通路富集分析（僅限于模式物種）
（7）差異基因GO功能富集分析（僅限于模式物種）
（8）已知mRNA表達量分析
（9）已知mRNA差異表達及聚類分析
（10）已知lncRNA表達量分析
（11）已知lncRNA差異表達及聚類分析
（12）預(yù)測新lncRNA
（13）新lncRNA鑒定和表達量分析
（14）新lncRNA差異表達及聚類分析
（15）新lncRNA家族分析
（16）SNP和Indel檢測與注釋
（17）生物學(xué)重復(fù)樣品間相關(guān)性分析
（18）蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析
（19）基因融合
（20）主成份分析（PCA）
（21）特征性差異表達基因分析
（22）lncRNA保守性分析
（23）可變剪切
3.2 高級分析
（1）已知mRNA-lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
（2）基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化及優(yōu)化基因的表達值計算
（3）eQTL分析
4、技術(shù)流程
5、案例分析
案例（1）外泌體傳遞lncARSR以提升腎癌細胞的舒尼替尼抗藥性
舒尼替尼耐藥是晚期腎細胞癌（RCC）治療的一個難點。了解這一耐藥現(xiàn)象的機制并制定抑制舒尼替尼耐藥的有效策略是目前臨床應(yīng)用中面對的重要問題。該研究確定了一個與舒尼替尼抵抗相關(guān)的lncRNA（命名為lncARSR）。在RCC細胞中，lncARSR通過競爭性結(jié)合miR-34/miR-449來促進AXL和c-Met表達而賦予細胞舒尼替尼抗性。此外，具有生物活性的lncARSR可以被納入外泌體并被傳輸?shù)绞婺崽婺崦舾行?/span>RCC細胞，從而傳播舒尼替尼抗性。對舒尼替尼抗藥性RCC施加舒尼替尼的同時靶向關(guān)閉lncARAR或同時施加AXL/c-MET抑制劑可以有效緩解腫瘤細胞對舒尼替尼抵抗。因此，lncARSR可用作預(yù)測和治療舒尼替尼耐藥的潛在治療靶標(biāo)。
圖1 lncARSR RCC舒尼替尼抗性通路的作用機制
案例（2）前列腺外泌體中lncRNA富含miRNA種子序列
本研究中分析了在幾組前列腺癌的外泌體和其親代細胞系的lncRNA表達情況。研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤細胞系來源外泌體均富含某些lncRNA。這些外泌體lncRNA本身富含miRNA種子序列，包括let-7家族成員以及miR-17，miR-18A，miR-20a，miR-93和miR-106b。并且在外泌體中同時伴隨高豐度相同種類的miRNA。此外，外泌體lncRNA也含有RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合序列，最常見的兩種基序是ELAVL1和RBMX。鑒于外泌體lncRNA富含miRNA種子序列與RBP部位，其相互作用可能會在前列腺癌癌變過程中發(fā)揮重要功能。
圖1 前列腺細胞外泌體中lncRNA的數(shù)量和表達差異
參考文獻
[1] Qu et al. Exosome-transmitted lncARSR promotes sunitinib resistance in renal cancer by act-ing as a competing endogenous RNA. Cancer Cell, 2016.
[2] Ahadi et al. Long non-coding RNAs harboring miRNA seed regions are enriched in prostate cancer exosomes. Scientific Reports, 2016.
