傳統(tǒng)的高通量測序是對某一組織整體的細胞合集進行測序和分析，而某一個細胞的基因信息則會被整體覆蓋。隨著高通量測序技術的發(fā)展，人們對基因組與表型之間的關系認識越來越深刻，單個細胞也有可能攜帶重要的信息。
10x單細胞測序是使用10x Genomics平臺，將單細胞懸液中的每個細胞分別進行標記，再通過逆轉錄和PCR建庫測序，分析單個細胞的轉錄組信息。單細胞測序可以揭示復雜細胞群體的異質性，避免單個細胞的基因表達信號被群體的平均化所掩蓋。
1、10x單細胞轉錄組測序實驗方案
測序策略：Illumina平臺PE150
數(shù)據(jù)量與捕獲的細胞數(shù)量相關，捕獲細胞越多，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也越多，具體如下：
2、單細胞轉錄組測序技術優(yōu)勢
（1）精準分選：利用10x Genomics平臺，實現(xiàn)真正的單細胞測序；
（2）細胞捕獲率高達65%，可實現(xiàn)大量單細胞的快速高效標記、測序和分析；
（3）項目周期短，技術應用范圍廣。
3、送樣建議
細胞樣本
聯(lián)系我們上門服務（提前10個工作日預約）。
血液樣本
抽取5ml人外周血加入到EDTA抗凝管中，分離PBMC后，聯(lián)系我們上門服務（提前10個工作日預約）。
組織樣本
方案一：取新鮮組織進行組織解離后，制備為細胞懸液，聯(lián)系我們上門服務（提前10個工作日預約）；
方案二：新鮮組織取黃豆大小（1-2mm3）剪碎后置于保存液（公司提供）中，48h內(nèi)冰袋運輸?shù)轿宜?。每個樣本至少準備兩管，一管作為備份。
注意事項：冰袋若從-80℃拿出，需放4℃冰箱2h。
4、技術流程
5、單細胞轉錄組測序信息分析
1測序數(shù)據(jù)質控和定量
1.1測序序列統(tǒng)計與質控
1.2數(shù)據(jù)定量
1.3多樣本數(shù)據(jù)合并和定量均一化
1.4最終鑒定細胞表達量矩陣
2細胞亞群分類
2.1細胞過濾
2.2單細胞亞群分類
3 Marker基因分析
4差異富集分析
4.1差異基因GO富集性分析
4.2差異基因KEGG富集性分析
5高級分析
5.1已知基因在細胞亞群表達分布及熱圖
5.2細胞分化擬時序分析
5.3細胞相互作用圖譜
5.4加權基因共表達（WGCNA）分析
5.5蛋白質互作網(wǎng)絡分析
5.6細胞周期鑒定
6、結果展示
圖1 PCA基因熱圖
圖2 單細胞亞群分類tSNE圖
圖3 擬時序軌跡圖
（擬時序分析（pseudotime），即構建細胞譜系發(fā)育，主要是判斷不同細胞表達量之間的關系，不同亞群之間表達量過渡的變化就是一條軌跡，這個時間并不是真的時間，而是一個虛擬的時序列，是指細胞與細胞之間的轉化和演替的順序和軌跡。Monocle是我們經(jīng)常用的擬時序分析工具，通過R語言讀取seurat對象后可進行數(shù)據(jù)分析，基于某些Marker基因表達模式，進而描繪細胞在隨時間發(fā)育過程的動態(tài)變化。）
圖4 擬時序變化相關基因（Top10\ Top50）表達分布圖\熱圖
7、單細胞轉錄組測序案例分析
Nature Immunology狼瘡性腎炎患者的腎臟免疫細胞組成單細胞測序分析
圖5 細胞亞型聚類圖
通過對LN患者和健康個體的腎臟、血液和尿液樣本進行單細胞轉錄組測序分析，結果顯示，血液與腎臟中檢測到的細胞分子特征存在相似性和差異性，而尿液與腎臟中白細胞亞群的分子活化狀態(tài)高度相關，有望作為腎臟活檢的代替物。
使用低分辨率聚類將所取腎臟細胞分為了10個集群，基于譜系標記基因和其他基因上調，將集群標記為髓細胞（C4, C6）、T/NK細胞（C0, C1, C2, C5）、B細胞（C3, C8）、分裂細胞（C9）和腎上皮細胞（C7）。接下來，將每個譜系的細胞分別進行聚類，一共確定了21個免疫細胞集群和一個上皮細胞集群（圖2）。
研究利用單細胞轉錄組學研究從LN患者和活體供體對照中獲得的腎臟樣本，揭示了LN腎臟免疫群體的復雜性，識別了髓細胞、NK細胞、T細胞和B細胞等多種疾病特異性亞群。研究發(fā)現(xiàn)：大量的分裂細胞和NK細胞，表明IFNγ和細胞溶解分子的主要來源，CD8+ T細胞中衰竭標記的少量表達表明了LN中的細胞毒性。浸潤白細胞的干擾素反應特征與血液中的相同特征相關，趨化因子受體CXCR4和CX3CR1在腎臟免疫細胞中頻繁表達，提示它們可能是潛在的治療靶點，尿液免疫細胞基因表達與相應的腎臟白細胞高度相關。
參考文獻 ：
[1] Arazi A., Rao, D. A., et al. (2019). The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis. Nature Immunology.
